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      《江苏大学》 2019年
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      两种酶偶联再生辅酶NAD(H)催化体系的构建及应用

      朱怡豪  
      【摘要】:辅酶原位再生系统是指在依赖辅酶的反应系统内部,用催化氧化/还原的方法实现辅酶在氧化态与还原态之间的循环。这种催化辅酶再生的方法可以大幅减少工业生产中辅酶的投入量,减少生产成本。本研究利用偶联醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶构建NADH再生系统,将该系统应用于药物中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]的合成。利用偶联阿拉伯糖醇脱氢酶和NADH氧化酶构建NAD~+再生系统,并应用于稀有糖L-木酮糖的合成,具体研究内容如下:(1)表达载体的构建和转化:从菌株Bartonella apis,Bacillus sp.ZJ和Aspergillus nidulans中抽提基因组DNA,通过PCR技术克隆出目的基因,根据来源物种名称,将醇脱氢酶,葡萄糖脱氢酶和阿拉伯糖醇脱氢酶分别命名为BaADH,BsGDH和ArDH。将目的基因连接到表达质粒pET-28a(+)上,并将重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21中。(2)酶的表达和性质表征:BaADH和ArDH的最适温度分别为50℃和40℃,分别在pH为8.0和9.5的缓冲液中表现出最大活性;添加Mn~(2+)能明显提高酶的活性。在30℃时,BaADH在保温35 h后失去一半活性,而ArDH的活性半衰期为8.3 h。米氏常数测定的结果显示,对于BaADH,V_(max)=190.4 U/mg,K_m=0.11mM;对于ArDH,V_(max)=9.1 U/mg,K_m=1.2 mM。(3)利用BaADH-BsGDH构建NADH辅酶再生体系,分别对反应温度、pH、辅酶浓度和底物浓度进行优化。结果表明,使用pH 7.0 Tris-HCl缓冲液,该催化系统在35℃反应8 h后,100 mM的COBE的转化率达到94.9%,NADH浓度为0.5μM时,辅酶总转化数(TTN)达到5940,可满足工业应用的要求。(4)利用ArDH-Nox构建NAD~+辅酶再生体系,对系统的催化反应条件进行优化。结果表明在pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中30℃催化氧化20 mM阿拉伯糖醇,反应8 h的转化率达到91.5%,NADH浓度为5μM时,最高TTN值为1020。本文建立了辅酶NAD(H)的酶偶联再生系统,利用该辅酶再生体系实现了药物中间体和稀有糖的酶促生产,体现辅酶再生系统在工业生产中的应用潜力。
      【学位授予单位】:江苏大学
      【学位级别】:硕士
      【学位授予年份】:2019
      【分类号】:R914

      【参考文献】
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      【共引文献】
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      5 李林波;罗宇;屈凌波;熊玉春;李凤娟;;NADH氧化酶研究进展[J];河南工业大学学报(自然科学版);2010年04期
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      【二级参考文献】
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      1 董志姚;李秀芬;刘立明;堵国成;陈坚;;过量表达NADH氧化酶加速光滑球拟酵母合成丙酮酸[J];微生物学报;2008年08期
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