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    《江苏大学》 2019年
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    营养缺乏条件下食管鳞癌细胞通过ACSS2/AMPK/PCNA信号途径维持增殖及诱导顺铂抵抗

    糜磊  
    【摘要】:【目的】探讨营养缺乏条件下食管鳞癌细胞ACSS2/AMPK/PCNA信号途径参与增殖维持及诱导化疗抵抗形成的分子机制。【方法】(1)免疫组化法对比、分析食管鳞状细胞癌患者(28例)肿瘤组织及癌旁正常组织中ACSS2表达差异;结合营养缺乏处理(限制血清浓度),通过CCK8实验探究食管鳞癌细胞株TE-1、ECA-109及正常食管鳞状上皮细胞Het-1A增殖能力的改变;RT-PCR及Western blotting法检测Het-1A及TE-1、ECA-109细胞中ACSS2随营养缺乏处理的表达变化;(2)正常培养与营养缺乏条件下,CCK8法检测靶向下调ACSS2(siRNA-ACSS2处理)前后食管鳞癌细胞增殖能力改变,结合流式细胞术探究siRNA-ACSS2处理对细胞周期分布影响;通过Western blotting检测营养缺乏条件下ACSS2表达与PCNA之间潜在联系;基于TUNEL及Annexin V-FITC/PI检测营养缺乏处理及ACSS2表达改变对顺铂杀伤食管鳞癌细胞后细胞凋亡水平作用;结合顺铂及siRNA-ACSS2处理,激光共聚焦、Western blotting法检测食管鳞癌细胞中ACSS2与PCNA、p-ATM、γH2AX等凋亡和DNA修复相关蛋白之间联系;siRNA–NC或siRNA-PCNA结合DDP处理,Western blotting法检测食管鳞癌细胞中PCNA与p-ATM、γH2AX的关系。(3)干扰ACSS2表达处理前后Western blotting法检测食管鳞癌细胞中AMPK信号通路活化变化;结合AMPK信号抑制剂Dorsomorphin,在食管鳞癌细胞中验证AMPK信号通路的抑制对PCNA表达的影响;(4)利用免疫组化对28例食管癌患者癌组织中ACSS2、PCNA、Ki-67的表达强度进行分级。采用卡方检验分析这些患者癌组织中ACSS2与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、PCNA、Ki-67的相关性,Kaplan-Meier分析ACSS2、PCNA、Ki-67与患者预后的关系。【结果】(1)ACSS2在食管癌组织及细胞中呈现高表达,营养缺乏对食管鳞癌细胞株增殖能力改变不显著且伴ACSS2的表达升高。在食管癌患者的癌组织及癌旁中ACSS2均有表达,在癌组织中表达强度更高,食管鳞癌细胞株TE-1及ECA-109中ACSS2的表达强度高于正常食管鳞状上皮细胞Het-1A;营养缺乏情况下TE-1和ECA-109细胞增殖能力分别下降了10.06±0.59%和7.68±0.64%,而Het-1A细胞增殖能力下降了41.64±0.72%;TE-1及ECA-109细胞中ACSS2 mRNA表达水平在短期内明显升高,而蛋白表达水平在短期及长期内均有成倍增加,正常食管鳞状上皮细胞中ACSS2表达量在营养缺乏的情况下mRNA水平及蛋白质水平表达量均没有明显增加;(2)ACSS2通过PCNA促进食管鳞癌细胞的增殖和DNA修复。干扰TE-1及ECA-109细胞中ACSS2表达后正常及营养缺乏的情况下细胞增殖能力均有降低,且营养缺乏情况下增殖能力受限的更加明显,相对于NS+NC组分别进一步下降了23.87±0.14%和16.95±0.53%;流式细胞术显示干扰ACSS2后细胞周期出现G2/M阻滞;随着ACSS2表达的下调PCNA的表达量也有不同程度的降低;TUNEL及Annexin V-FITC/PI检测结果显示营养缺乏与否及ACSS2的表达高的对ECA-109细胞凋亡均无明显影响,在加入DDP的条件下,ACSS2干扰组细胞凋亡率明显升高,并且营养缺乏的情况下最为明显;正常及营养缺乏的情况下,ACSS2的表达高低对DNA损伤修复相关蛋白p-ATM、γH2AX及抗凋亡蛋白Bcl-xL无影响,加入DDP后下调ACSS2的表达,p-ATM、γH2AX明显升高,Bcl-xL呈下降趋势。正常及营养缺乏的情况下干扰PCNA的表达,在加入DDP后p-ATM、γH2AX表达升高。(3)ACSS2与AMPK协同调控PCNA的表达。营养缺乏会引起p-AMPK的堆积,干扰ACSS2后p-AMPK表达量减少;在正常及营养缺乏的情况下食管鳞癌细胞中加入AMPK信号通路抑制剂Dorsomorphin后,PCNA的表达随之下降,同时也影响到了ACSS2的表达;(4)ACSS2的表达情况与患者的预后相关。28例食管鳞状细胞癌患者中,ACSS2的表达强度与PCNA和Ki-67的表达强度呈正相关,而与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期无显著相关性,ACSS2高表达与患者预后不良有关。【结论】在营养缺乏的情况下,食管鳞癌中ACSS2与AMPK信号通路协同维持PCNA的表达,进而促进细胞增殖及顺铂耐药性。
    【学位授予单位】:江苏大学
    【学位级别】:硕士
    【学位授予年份】:2019
    【分类号】:R735.1

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