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      《江苏大学》 2019年
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      NFAT2在原发性肝细胞癌中的作用及其机制的研究

      沈晓峰  
      【摘要】:目的:研究激活的T细胞核因子2(nuclear factor of activated T cells 2,NFAT2)的3种亚型isoformB,isoformD,isoformE在原发性肝癌细胞中的作用;及研究过表达NFAT2基因亚型isoformB在其促进肝癌细胞凋亡中的机制。方法:(1)选取肝癌细胞系(PLC、HepG2、Huh7、Hep3B)及正常肝细胞系L02,通过蛋白质印迹法检测NFAT2在肝癌细胞系及正常肝细胞系中表达情况。(2)通过提取肝癌细胞RNA,逆转录及PCR技术获得目的基因;再通过限制性内切酶酶切,目的基因与载体DNA连接,DH5α菌的转化、筛选及鉴定,最后提取质粒DNA等方法构建pcDNA3.1-NFAT2的isoformB,isoformD,isoformE不同亚型真核载体质粒。(3)用不同的肝癌细胞系进行实验,转染构建好的pcDNA3.1-NFAT2 isoformB,isoformD,isoformE载体质粒,通过流式细胞术检测NFAT2过表达后对肝癌细胞系凋亡的影响。(4)为了进一步探究NFAT2以何种机制发挥其抑癌基因的作用,我们通过转染NFAT2 isoformB过表达质粒,qRT-PCR法检测集中候选的可能的下游靶基因的mRNA变化。(5)通过过表达NFAT2 isoformB来检测FasL,Caspase-8,Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达,了解肝癌细胞中过表达NFAT2对蛋白表达的影响。(6)通过前面的研究发现NFAT2能抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡,并且NFAT2能上调FasL表达。为了进一步明确FasL在NFAT2抑制细胞增殖和促凋亡过程中的作用,我们构建了针对FasL基因siRNA,使用Huh7和PLC肝癌细胞系分别共转染NFAT2过表达质粒和FasL siRNA,通过CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:(1)Western Blot结果表明,NFAT2蛋白在四种肝癌系中较正常肝细胞系L02表达下降,肝癌细胞系PLC、HepG2、Huh7、Hep3B较正常肝细胞系L02中表达均下降,蛋白相对表达量较L02下降均具有统计学意义(P0.05)。(2)细胞流式术结果显示,转染NFAT2 isoformB,isoformD,isoformE质粒后,不同的肝癌细胞系的凋亡率都提高(P0.05)。(3)在肝癌细胞系Huh7中过表达NFAT2 isoformB,qRT-PCR检测几种候选的下游靶基因,我们发现FasL基因mRNA有明显上升(P0.05)。(4)Western Blot结果表明:NFAT2 isoformB过表达质粒转染后,FasL、Caspase-8和Caspase-3凋亡蛋白表达上升(P均0.05),而Caspase-9并没有明显变化(P0.05)。(5)共转染NFAT2 isoformB过表达质粒和FasL siRNA后,si-FasL+NFAT2组比si-NC+NFAT2组增殖速率要快,并且凋亡率要小(P0.05)。结论:(1)肝癌细胞中NFAT2的表达较正常肝细胞低。(2)NFAT2的各种亚型对肝癌细胞具有一致的促凋亡作用。(3)在肝癌细胞中,NFAT2是通过介导FasL激活细胞凋亡通路来发挥促凋亡作用的。(4)在肝癌细胞中,siRNA沉默FasL介导的通路,可以消除NFAT2的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡作用。
      【学位授予单位】:江苏大学
      【学位级别】:硕士
      【学位授予年份】:2019
      【分类号】:R735.7

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