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    《華中農業大學》 2004年
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    蓮房原花青素對口腔癌的藥理作用及其機制研究

    杜曉芬  
    【摘要】:原花青素類化合物廣泛的分布于植物界,由于其很強的抗氧化和清除自由基的能力及多種藥理作用,使其在食品、醫藥、化妝品等領域得到了廣泛的應用。惡性腫瘤是危害人類生命和健康的一種嚴重疾病,不少國家因惡性腫瘤死亡的人數占總死因首位;而口腔癌約占全部腫瘤的3%(瑞典)、5%(美國)、到40%(東南亞及印度)不等,口腔鱗狀細胞癌約占口腔癌的80%以上。據報道原花青素類化合物對口腔癌、皮膚癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌等都有一定的預防或治療作用。蓮房原花青素(LSPC)由本研究室研究開發,并已發現有多種藥理作用。本論文從細胞水平、亞細胞水平及整體動物水平研究LSPC對口腔癌的藥理作用。通過細胞生長實驗和形態學觀察,首次證明了LSPC對人口腔表皮樣癌(KB)細胞具有毒性作用,這種毒性作用的機制是LSPC可誘導KB細胞凋亡,影響KB細胞表面黏附分子CD44的表達;同時在整體動物水平上首次證明了LSPC對DMBA誘發金黃地鼠頰囊癌變具有化學預防作用。以此為拓寬蓮房原花青素的應用及為口腔鱗癌的防治提供科學依據。 主要研究結果如下: 1.LSPC對KB細胞生長的影響 運用MTT法測定了LSPC對KB細胞增殖的抑制作用及對小鼠成纖維細胞L929的毒性,以選出LSPC對KB細胞最佳作用濃度作后續研究。當LSPC與KB細胞和L929細胞分別作用24h時,LSPC濃度在100~1000μg/mL時能顯著的抑制KB細胞的生長且呈劑量效應關系,但在50μg/mL時顯著的促進KB細胞的生長;同時,LSPC濃度在400~1000μg/mL時,顯著的抑制了L929細胞的 蓮房原花青素對口腔癌的藥理作用及其機制研究 生長,但在100一300林g/mL時不影響其生長,而在50協歲mL時又顯著的抑制了 其生長,提示LSPC對癌細胞的毒作用和對正常細胞的保護作用有一個最佳的劑 量范圍。綜合兩者,可得LsPc對KB細胞最佳作用濃度為200一400協g/mL。 2.LSPC對KB細胞形態的影響 采用相差顯微鏡、HE常規染色光學顯微鏡和透射電鏡觀察了LSPC對KB 細胞作用引起的形態變化。用不同濃度的LSPC作用KB細胞后,相差顯微鏡下 可見細胞變圓、變小,細胞膜透亮,細胞漂浮,表明細胞分裂減少,生長受到抑 制。HE常規染色光鏡下可見細胞核向細胞膜邊集、突出,細胞皺縮、變圓、變 小,出現碎核,表明LSPC對KB細胞有細胞毒作用,且細胞呈現凋亡現象。透 射電鏡下可見橋粒結構消失,細胞萎縮,胞內出現大量的空泡,染色質邊集,斷 裂等,出現凋亡的典型特征。以上三者結果均表明,LSPC可顯著的抑制KB細 胞的生長、改變KB細胞形態,并誘導KB細胞凋亡。 3.LSPC誘導KB細胞凋亡作用研究 運用流式細胞儀,采用PI染色法和FITC-annexinV/Pl法,觀察不同濃度 LSPC誘導KB細胞凋亡作用,并通過檢測KB細胞表面蛋白CD95表達量探討 LSPC誘導KB細胞凋亡途徑。PI染色法結果顯示,LSPC濃度在200林創mL、 30卯創mL、40卯歲mL時,分別有7.5%、8.3%、17.5%KB細胞處于凋亡后期或 已經壞死或是兩者的混合;FITC一annexinV/PI法結果顯示,當LSPC濃度在 20即g加L時,部分KB細胞處于凋亡早期,而LsPc濃度在300林g/mL、400拼g/mL 時,部分KB細胞處于凋亡后期或已經壞死或兩者皆有。表明LSPC可誘導KB 細胞凋亡,同時也可引起KB細胞壞死,且呈劑量效應關系。但隨著LSPC濃度 的增加,CD95蛋白表達量呈下降趨勢,即KB細胞可由Fas途徑引起凋亡的細 胞數減少,與LSPC可誘導KB細胞凋亡作用結果不一致。這可能是LSPC與細 胞表面蛋白CD95結合,從而阻礙了CD95一PE抗體與其結合,影響了測定結果; 也可能是LSPC影響了CD95的表達量,LSPC誘導KB細胞凋亡作用不是通過 Fas途徑。由此可見,LSPC能誘導KB細胞凋亡,但凋亡途徑尚待進一步研究 證明。 杜曉芬華中農業大學碩士學位論文 4.LSPC對KB細胞表面豁附分子CD44蛋白表達量的影響 采用流式細胞術觀測了LSPC對KB細胞表面豁附分子CD44v和CD44S蛋 白表達量的影響。當KB細胞分別與100卜g/mL、200卜g/mL、300卜g/mL、400“g/mL LSPC作用時,CD44v蛋白表達量由6.31%分別上升至1 2.6%、18.1%、27.9%、 39.3%;而分別與300拼g/mL、400件留mL LSpC作用時,CD44s蛋白表達量由89.9% 分別下降至68.4%、56.3%。提示LSPC可改變KB細胞表面勃附分子CD44v和 CD44S蛋白的表達量,從而起到抑制腫瘤的浸潤和轉移作用。 5.LSPC對DMBA誘發金黃地鼠頰囊癌變的防治作用研究 整體動物實驗結果表明,當用10Omgfkg·bw·d LSPC灌胃或涂布金黃地鼠頰 囊時,以肉眼觀察頰囊粘膜的變化、體重變化、死亡率、實驗結束后被處死動物 的心、肝、脾、肺、腎等臟器重量,以及血清中MDA、GSH一Px、T一SOD值和口腔 粘膜組織常規HE染色病理觀察等為指標,觀察LSPC對DMBA誘發的金黃地鼠頰 囊癌變的防治作用,結果表明: 灌胃和涂布LSPC對DMBA誘發金黃地鼠頰囊癌變均具有預防性效果,且以涂 布LSPC的預防效果較佳。并研究表明灌胃LSPC主要通過降低機體自由基水平, 提高機體抗氧化能力而起到作用;涂布LSPC主要是直接隔離DMBA對地鼠頰囊勃 膜的激癌作用,以及降低機體內的自由基水平和提高機體的抗氧化能力的共同作 用的結
    【學位授予單位】:華中農業大學
    【學位級別】:碩士
    【學位授予年份】:2004
    【分類號】:R739.8

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