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      《湖南农业大学》 2018年
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      猪TGEV N蛋白单克隆抗体的研制及夹心ELISA方法的初步建立

      王赛  
      【摘要】:猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪严重的腹泻并可导致仔猪死亡,尤其是2周龄以内仔猪死亡率高达100%,很容易和其它肠道病毒发生混合感染,并且和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的临床症状极为相似,给病原的检测造成困扰。本实验用抗TGEV重组N蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体建立一种捕获抗原的双抗体夹心ELISA检测方法,经过检验,效果良好,可以做为病原诊断的可靠简便的方法。本研究从以下几个方面展开:1、抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的制备。利用大肠杆菌原核表达系统表达TGEV重组N蛋白,经过纯化和鉴定后免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按常规方法融合筛选后得到2株能稳定分泌抗重组N蛋白抗体的杂交瘤细胞株2G7和2C2。2株单抗亚类均为IgG1;间接免疫荧光表明2株单抗能识别细胞中的TGEV,感染细胞呈现亮绿色荧光;杂交瘤细胞培养上清效价稳定在1:12800;腹水的间接ELISA效价均为1:10~8。结果表明2株单抗细胞株遗传稳定,分泌的抗体特异性好。2、抗TGEV全病毒和重组N蛋白多抗血清的制备。将纯化的病毒和重组N蛋白分别免疫家兔,采集血清经过蛋白A亲和层析纯化得到2种多抗血清,间接ELISA效价分别为1:204800和1:25600,BCA方法测定浓度分别为51.64mg/ml和37.28mg/ml。3、双抗体夹心ELISA检测方法的建立。将2株单抗和2种多抗分别配对,结果显示2C2单抗为捕获抗体,N蛋白多抗为检测抗体时检测效果最好。优化条件为:2C2单抗稀释1000倍于37℃包被2h,N蛋白多抗稀释1000倍37℃孵育1h,病毒抗原37℃孵育2h,酶标抗体稀释2000倍在37℃反应30min,底物于室温显色15min。建立好的检测方法经过特异性、敏感性和重复性等检测,表明该方法能特异地捕获TGEV的抗原并和PEDV、PRV没有交叉反应,能检出的病毒最低浓度为13.37μg/ml,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,重复性良好。
      【学位授予单位】:湖南农业大学
      【学位级别】:硕士
      【学位授予年份】:2018
      【分类号】:S858.28

      【参考文献】
      中国期刊全文数据库 前10条
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      9 葛晨霞;王龙涛;马磊;胡桂学;;猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测技术研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年12期
      10 南文金;娄高明;;猪传染性胃肠炎病毒分子结构、检测和疫苗研究进展[J];畜牧与兽医;2010年12期
      【共引文献】
      中国期刊全文数据库 前10条
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      7 王黎;李碧;周远成;朱玲;徐志文;郭万柱;;猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J];中国兽医学报;2015年02期
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      【二级参考文献】
      中国期刊全文数据库 前10条
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      10 张坤;何启盖;;猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J];畜牧兽医学报;2010年08期
      【相似文献】
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      8 修晶辉;李伟娜;尹鑫;刘宁;魏萍;;一株仔猪肠道益生菌抗TGEV作用初探[J];黑龙江畜牧兽医;2012年03期
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      10 王劭;陈少莺;林锋强;程晓霞;江斌;陈仕龙;林琳;朱小丽;;猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J];动物医学进展;2007年11期
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      2 Wang li;Dai xianjin;Song han;Zhou yue;Ye cuifang;Hu yang;Song zhenhui;;Construction of recombinant baculovirus expressing TGEV spike protein S2 and the preliminary research of its immunogenicity[A];第七届中国畜牧科技论坛论文集[C];2016年
      3 张小波;左玉柱;刘媛;范京惠;李潭清;李建辉;孙彦新;;猪传染性胃肠炎病毒M蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
      4 王劭;陈少莺;林锋强;程晓霞;江斌;陈仕龙;林琳;朱小丽;;猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用[A];福建省科协第七届学术年会分会场——“坚持科技创新,建设海西现代畜牧业”研讨会论文集[C];2007年
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      6 Dai xianjin;Ye cuifang;Li yuntian;Wang li;Hu yang;Song zhenhui;;Morphogenesis and Proliferative Rule of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus in SIEC[A];第七届中国畜牧科技论坛论文集[C];2016年
      7 杨百亮;冯力;赵翠萍;孙东波;张建斌;;抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
      8 孙东波;冯力;刘杰;时洪艳;佟有恩;刘胜旺;童光志;;猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
      9 黄小波;曹三杰;文心田;;猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的初步构建[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年
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      9 彭树英;TGEV S基因的克隆、表达及转基因小鼠的制备[D];西北农林科技大学;2007年
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      2 师一鸣;TGEV单克隆抗体的制备及检测方法的建立[D];东北农业大学;2019年
      3 王洪微;猪传染性胃肠炎病毒M蛋白诱导IFN-β表达分子机制及功能域研究[D];东北农业大学;2019年
      4 王赛;猪TGEV N蛋白单克隆抗体的研制及夹心ELISA方法的初步建立[D];湖南农业大学;2018年
      5 戴磊;TGEV感染对猪肠上皮细胞葡萄糖和精氨酸吸收影响机制的研究[D];南京农业大学;2017年
      6 王晓青;枯草芽孢杆菌及其表面活性素抑制TGEV入侵猪肠上皮细胞的初步探究[D];南京农业大学;2017年
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      8 杨舟;TGEV感染IPEC-J2细胞通过EGFR/ERK通路调控NHE3动态运输的机制研究[D];西南大学;2018年
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