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    《湖南农业大学》 2018年
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    烟芽夜蛾囊泡病毒RT-qPCR内参基因的筛选、基因组学和蛋白组学研究

    陈子姝  
    【摘要】:囊泡病毒是一类主要感染甜菜夜蛾Spodoptera exigua、斜纹夜蛾Spodoptera litura、棉铃虫Helicoverpa armigera等鳞翅目夜蛾科幼虫的双链环状DNA昆虫病毒,宿主幼虫感病后表现出明显的“急性致病”、“慢性致死”症状。自然界中,囊泡病毒主要通过寄生蜂的产卵行为进行传播,在甜菜夜蛾等重要害虫的生物防治领域具有较好的潜在应用价值,但就分子机理研究而言相对缺乏。本论文就烟芽夜蛾囊泡病毒Heliothis virescens ascovirus(HvAV)传播体系中各组件RT-qPCR内参基因开展了筛选工作,并且以新发现的毒株烟芽夜蛾囊泡病毒3i株(HvAV-3i)为例,结合其他已报道的毒株基因组学和蛋白组学进行了系统的比较分析,主要研究结果如下:1、囊泡病毒RT-qPCR内参基因筛选以烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(HvAV-3h)为例,取病毒血淋巴(5.6×10~8 pfu/ml)以10~(-0)、10~(-2)、10~(-4)、10~(-6)和10~(-8)倍进行梯度稀释,病毒稀释液针刺感染甜菜夜蛾,分别于不同实验处理时间点收集样品,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFidner和Delta Ct法对14个候选内参基因进行评估,分别为:肌动蛋白1(β-actin1,ACT1)、肌动蛋白2(β-actin2,ACT2)、转录延伸因子1(elongation factor 1,EF1)、转录延伸因子2(elongation factor 2,EF2)、核糖体蛋白L10(ribosomal protein L10,L10)、核糖体蛋白L17A(ribosomal protein L17A,L17A)、过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、28S核糖体RNA(28S ribosome,28S)、微管蛋白(Tubulin,TUB)、18S核糖体(18S ribosome,18S)、焦谷氨酰蛋白酶(peptidyl prolyl isomerase A,PPI)、TATA盒结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和核糖体蛋白L35(ribosomal protein L35,L35)。结果表明在HvAV-3h感染甜菜夜蛾和斯氏侧沟茧蜂中EF1为最适内参基因;EF2和28S分别为SeFB和Sf9细胞系中最适内参基因。通过iap-like1和iap-like2基因的表达水平,证实了内参基因的稳定性。2、囊泡病毒基因组学分析以本研究新记载并命名的烟芽夜蛾囊泡病毒3i株(HvAV-3i)为例分析囊泡病毒基因组特征,HvAV-3i的基因组大小为185,650 bp,G+C含量为45.4%,共预测出181个开放阅读框,其中包括4个特有基因、25个杆状病毒重复基因(bro)、5个微卫星位点区域,但没有检测到同源重复区域(hrs)。在HvAV-3i基因组分析过程中,首次在序列中发现了3个仅存在于囊泡病毒中特有的重复基因,并称之为囊泡病毒重复基因(aro),对囊泡病毒序列中所有aro进行聚类分析,结果表明,29个aros基因被分成了7组,并对其结构域进行了初步了解。此外,基于所有囊泡病毒属共有基因的联合分析,构建系统发育树,明确了烟芽夜蛾囊泡病毒各变种间的系统地位,其系统演化关系为(HvAV-3f,(HvAV-3h,(HvAV-3e,(HvAV-3g,HvAV-3i))))。3、囊泡病毒蛋白组学分析以HvAV-3i为例,基于胶内酶解和溶液酶解,对其病毒粒子进行了蛋白组学分析,从中共鉴定出了81个HvAV-3i病毒粒子携带的病毒蛋白。在这些蛋白中,35个病毒蛋白可能参与DNA/RNA的代谢/转录、病毒粒子装配、糖类/脂质代谢、细胞内信号传导/自稳态和细胞裂解等途径。20个病毒蛋白中含有跨膜结构域。蛋白组学的研究有利于研究者深入了解囊泡病毒病毒粒子结构,病毒蛋白和宿主蛋白的功能结构域分析,为进一步了解囊泡病毒感染寄主过程提供了坚实的基础。
    【学位授予单位】:湖南农业大学
    【学位级别】:硕士
    【学位授予年份】:2018
    【分类号】:S476.13

    【参考文献】
    中国期刊全文数据库 前1条
    1 江幸福,罗礼智,胡毅;幼虫食物对甜菜夜蛾生长发育、繁殖及飞行的影响[J];昆虫学报;1999年03期
    【共引文献】
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    10 范锦胜;张李香;王贵强;马淑梅;邵红涛;;甜菜夜蛾幼虫对寄主植物的选择及营养利用[J];中国农学通报;2011年30期
    【二级参考文献】
    中国期刊全文数据库 前1条
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    【相似文献】
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