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    《廣西大學》 2014年
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    紅麻CMS系和保持系能量代謝相關基因的克隆、表達及RNAi載體構建

    黃志鵬  
    【摘要】:紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維經濟作物,因其良好的纖維品質得到廣泛應用。紅麻具有極強的雜種優勢,利用紅麻細胞質雄性不育系(CMS)培育紅麻雜交品種是雜種優勢利用的主要途徑,因此,揭示紅麻CMS機理具有重要的理論意義和實際價值。 大量研究表明,花藥發育小孢子時期的能量供應不足會導致CMS發生。目前,在對紅麻CMS分子機制的研究中,有關能量代謝差異表達基因的研究主要集中于線粒體相關基因,然而,植物體的能量代謝是核與質相互協調的過程,因此研究不育系(P3A)和保持系(P3B)的核能量代謝差異表達基因對了解CMS植物體能量代謝的核與質相互協調機理是非常有益的探索過程。本課題組的前期工作通過DNA芯片技術和紅麻花藥轉錄組高通量測序技術證實,戊糖磷酸途徑關鍵酶基因6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6-PGDH)和短鏈醇代謝的關鍵酶乙醇脫氫酶基因(Alcohol dehydrogenase,ADH1)在不育系和保持系中差異表達。為了更好的研究細胞質雄性不育與能量代謝差異基因之間的關聯,本研究以紅麻不育系(P3A)及相應保持系(P3B)為實驗材料,提取了高質量紅麻總DNA和總RNA,克隆了戊糖磷酸途徑關鍵酶基因6-PGDH和短鏈醇代謝的關鍵酶乙醇脫氫酶基因(ADH1);同時對這兩個基因進行了半定量RT-PCR分析;并構建6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶RNA干擾載體,主要結果如下: (1)成功的從紅麻花藥中提取了高質量的總DNA和總RNA。 (2)根據不育系(P3A)和保持系(P3B)花藥轉錄組高通量測序結果,參考前期DNA微陣列差異分析結果,嚴格篩選相關差異基因序列片段,同時參考同源克隆所得片段,并提交NCBI,以Blast N,Blast P進行檢索,再與其他物種的6-PDGH和ADHl基因序列進行同源性比對。在確認數據可信度的前提下,用生物信息學方法獲得全長cDNA拼接序列,并分別以紅麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花藥cDNA以及總DNA為模板克隆了紅麻6-PGDH基和ADH1基因全長。測序分析結果表明,紅麻6-PGDH和ADH1基因擴增序列與其它植物的6-PGDH和ADHl基因保守序列具有很高的同源性,說明所擴增的片段是正確的基因片段。紅麻6-PGDH基因在P3A(RNA)、P3B(RNA)、總DNA中PCR擴增產物的CDS區大小均為1458bp,編碼485個氨基酸殘基,無內含子。紅麻ADH1基因在P3A(RNA)、P3B(RNA)中PCR擴增產物長度均為1300bp,在總DNA中PCR擴增產物長度為2256bp,PCR擴增產物的CDS區大小均為1071bp,編碼356個氨基酸殘基,包含8個外顯子。 (3)半定量RT-PCR分析得出:紅麻6-PGDH和ADH1基因在保持系(P3B)中的表達量明顯大于不育系(P3A)。 (4)本研究以紅麻6-PGDH基因為靶基因,構建特異沉默該基因的RNAi干擾載體。實驗檢測結果表明,以紅麻6-PGDH基因為靶標的RNAi表達載體(pAR27-pKANNIBAL-R1+2)構建成功,正向、反向干擾片段均為389bp。RNAi載體的構建為進一步研究紅麻6-PGDH基因的功能奠定了基礎,目前,利用花粉管通道法進行遺傳轉化的研究正在進行中。
    【學位授予單位】:廣西大學
    【學位級別】:碩士
    【學位授予年份】:2014
    【分類號】:S563.5

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