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    《遵義醫科大學》 2019年
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    厄洛替尼對人非小細胞肺癌細胞放射敏感性的影響及其機制研究

    劉大海  
    【摘要】:目的:表皮生長因子受體在非小細胞肺癌放療抵抗中有重要作用,本研究擬探討表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑對人非小細胞肺癌細胞放射敏感性的影響及其可能的機制。方法:體外培養3種人非小細胞肺癌細胞A549、H1299、PC9。CCK-8檢測厄洛替尼對3種細胞的殺傷作用,并計算IC50及IC20,將每種細胞各自的IC20作為后續試驗的藥物作用濃度。根據X線照射之前是否聯用厄洛替尼將3種細胞分成空白對照組(NC)、單用厄洛替尼組(E)、單純放療組(R)及厄洛替尼+放療組(E+R)4組。克隆形成實驗檢測射線聯用或不聯用厄洛替尼對3種細胞的作用,計算放射敏感性參數,繪制細胞存活曲線。流式細胞術檢測各組細胞凋亡及細胞周期分布情況。qRT-PCR檢測各組細胞EGFR/PI3K/AKT通路、Rab25基因、凋亡相關蛋白mRNA及miR125a-5p、MALAT1表達水平。Western blot技術檢測各組細胞EGFR/PI3K/AKT通路、Rab25及凋亡相關蛋白表達水平。以此探索厄洛替尼對非小細胞肺癌細胞放射增敏的可能機制。結果:1.CCK-8結果顯示厄洛替尼對3種細胞均具有增殖抑制作用。A549細胞的IC50為(18.167?3.683)μmol/L、IC20為(0.860?0.196)μmol/L,H1299細胞的IC50為(27.297?4.220)μmol/L、IC20為(3.324?0.253)μmol/L,PC9細胞的IC50為(0.137?0.024)μmol/L、IC20為(0.011?0.002)μmol/L。與其他兩種細胞相比,PC9細胞對厄洛替尼更為敏感。2.克隆形成實驗結果顯示在X射線照射之前聯用厄洛替尼能夠減少A549和H1299細胞的克隆數,降低克隆形成率,同時兩種細胞厄洛替尼+放療組D_q、D_0、SF_2均較單純放療組D_q、D_0、SF_2小,SER值分別為1.248、1.244,差異具有統計學意義。然而PC9細胞未見與A549、H1299細胞類似的結果,厄洛替尼+放療組與單純放療組D_q、D_0、SF_2差異不具有統計學意義,SER值為1.053。說明厄洛替尼能增加射線對A549細胞、H1299細胞的殺傷作用,不增加其對PC9細胞的殺傷作用。3.流式細胞術結果顯示厄洛替尼增加射線誘導的A549、H1299細胞凋亡率,不能增加射線誘導的PC9細胞凋亡率。周期結果顯示厄洛替尼能讓A549、H1299、PC9三種細胞阻滯在G_0/G_1期,S期比例降低。當與射線聯合作用之后,使A549、H1299細胞G_0/G_1期比例進一步增加,進一步降低S期比例,同時讓G_2/M期比例增加。然而與單純照射組相比,厄洛替尼與射線聯合作用于PC9細胞后,并未讓PC9細胞G_0/G_1期比例、S期比例、G_2/M期比例產生明顯變化。4.qRT-PCR檢測結果顯示,與R組相比,A549細胞E+R組AKT基因mRNA表達降低,H1299細胞E+R組PARP基因mRNA表達增加,PC9細胞E組和E+R組EGFR基因mRNA表達均降低。3種細胞各處理組間miR125a-5p、MALAT1表達無統計學差異。5.Western blot結果顯示厄洛替尼能夠抑制3種細胞pEGFR及pAKT表達,單純照射未引起pEGFR及pAKT發生明顯改變。與單用厄洛替尼組相比,放療+厄洛替尼引起A549、H1299細胞pEGFR及pAKT表達進一步抑制,未引起PC9細胞pEGFR及pAKT表達進一步降低。與單用厄洛替尼組和單純照射組兩組相比,厄洛替尼+放療引起A549、H1299細胞Active Caspase 3、Cleaved PARP表達增加,同時抑制A549細胞EGFR表達、促進Caspase 3表達,但是不提高PC9細胞Active Caspase 3、Cleaved PARP表達。由于A549細胞和H1299細胞Rab25表達量太低,Western blot檢測未檢測到該兩種細胞蛋白表達。對于PC9細胞,厄洛替尼未引起Rab25蛋白表達發生明顯變化,單純照射能抑制Rab25蛋白表達,但厄洛替尼與射線聯用未進一步抑制Rab25蛋白表達。結論:厄洛替尼能增加EGFR野生型NSCLC細胞A549及H1299放射敏感性,但不增加EGFR突變型NSCLC細胞PC9放射敏感性。其可能的機制與厄洛替尼聯合射線使EGFR野生型NSCLC細胞A549及H1299細胞EGFR/PI3K/AKT通路進一步抑制,改變細胞周期進程,增加細胞凋亡有關。
    【學位授予單位】:遵義醫科大學
    【學位級別】:碩士
    【學位授予年份】:2019
    【分類號】:R734.2

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