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      《遵義醫科大學》 2019年
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      MiR-581通過介導PRDX1影響結直腸癌細胞轉移的機制研究

      張紅  
      【摘要】:目的:本研究擬在研究mi R-581與PRDX1之間的靶向調控關系,探討mi R-581是否可通過參與介導PRDX1來影響結直腸癌細胞侵襲遷移機制。方法:1.構建PRDX1野生型及mi R-581結合位點突變型報告基因載體,分別與mi R-581 mimics及空載共轉染至293T細胞,48h后收樣,檢測熒光素酶活性。2.構建mi R-581過表達及沉默慢病毒載體,分別感染原發結直腸癌細胞株SW480(LV-mi R-581,LV-mi R-581 KD),感染空載慢病毒為對照組(Control)。感染48 h后,熒光顯微下觀察感染效果,且利用q RT-PCR檢測感染后的細胞mi R-581的表達水平進行驗證;分別利用劃痕、transwell侵襲功能學實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化;再將LV-mi R-581(PRDX1表達降低)感染組SW480細胞感染PRDX1過表達病毒載體(LV-mi R-581+LV PRDX1),LV-mi R-581 KD(PRDX1表達增高)感染組細胞感染PRDX1沉默病毒載體(LV-mi R-581 KD+LV PRDX1 RNAi),感染后,利用q RT-PCR分別檢測上述各組細胞中PRDX1的表達水平;最后,分別利用劃痕、transwell侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化的功能實驗。3.分別利用q RT-PCR和Western blot檢測上述感染細胞中EMT遷移相關因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、MMP-7及MMP-9等m RNA和蛋白的表達情況,探討mi R-581是否可通過介導PRDX1的表達而影響EMT過程,進而影響結直腸癌細胞的遷移。用Western blot檢測m TOR通路的下游信號分子p70S6K及磷酸化水平,初步探討m TOR/p70S6K信號通路是否參與了mi R-581-PRDX1對結直腸癌細胞的侵襲及遷移的調控作用。結果:1.當過表達mi R-581時,PRDX1野生組的熒光素酶活性降低,而PRDX1突變組無明顯變化。2.慢病毒載體感染SW480細胞48 h后,觀察兩組細胞熒光表達率均在90%以上,q RT-PCR驗證結果顯示:LV-mi R-581(結果PRDX1表達降低)細胞中mi R-581的表達增高(P0.05),LV-mi R-581 KD(結果PRDX1表達增高)細胞中的mi R-581表達降低(P0.05),LV-mi R-581+LV PRDX1中PRDX1表達增高(P0.05),LV-mi R-581 KD+LV PRDX1 RNAi中PRDX1表達降低(P0.05)。劃痕和Transwell侵襲實驗結果顯示:LV-mi R-581細胞的遷移和侵襲能力降低(P0.05),LV-mi R-581 KD細胞的遷移和侵襲能力增強(P0.05);LV-mi R-581+LV PRDX1細胞遷移和侵襲能力較LV-mi R-581增強,LV-mi R-581 KD+LV PRDX1 RNAi細胞遷移和侵襲能力較LV-mi R-581 KD降低。3.SW480細胞過表達mi R-581后,LV-mi R-581細胞(結果PRDX1表達降低)的上皮標記因子E鈣粘蛋白(E-cadherin)表達水平增高(P0.05),而間質標記因子N鈣黏蛋白、波形蛋白(N-Cadherin,Vimentin)的表達水平降低(P0.05),促EMT轉錄因子Snail和Slug和表達降低,而過表達PRDX1后可以反轉mi R-581的作用影響。SW480細胞沉默mi R-581后,LV-mi R-581 KD細胞(結果PRDX1表達增高)E-cadherin表達水平下降(P0.05),而N-Cadherin,Vimentin的表達水平升高(P0.05),促EMT因子金屬蛋白MMP9表達水平高。而沉默PRDX1后可以反轉結果。Western blot中,LV-mi R-581細胞E-cadherin的表達增多(P0.05),而Vimentin、N-cadherin表達減少(P0.05),促EMT因子Snail和MMP9表達降低,當沉默mi R-581后得到相反結果,且用PRDX1干擾后可反轉mi R-581的作用。4.SW480細胞過表達或沉默mi R-581及用PRDX1干擾后,m TOR表達無明顯變化,過表達mi R-581后,m TOR下游信號中磷酸化p70S6K蛋白表達量降低(P0.05),用PRDX1干擾后表達又增高;當沉默mi R-581后,m TOR下游信號磷酸化p70S6K蛋白表達量增高(P0.05)用PRDX1干擾后表達增高。結論:1.PRDX1是mi R-581的靶點,且存在負性調控關系。2.mi R-581可以抑制結直腸癌細胞的侵襲遷移能力,但PRDX1可以反轉mi R-581的作用。3.Mi R-581可能通過介導PRDX1的表達來調控上皮-間質轉化(EMT)而影響結直腸癌細胞的侵襲和遷移能力,并有可能通過m TOR/p70S6K信號通路發揮作用。
      【學位授予單位】:遵義醫科大學
      【學位級別】:碩士
      【學位授予年份】:2019
      【分類號】:R735.34

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