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      《西北大學》 2001年
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      高梁CMS相關DNA片段的序列分析及A/B核DNA上的差異研究

      范昌發  
      【摘要】: 植物細胞質雄性不育(CMS)是指不遵守孟德爾法則而表現為母性遺傳的植物雄性不育類型。CMS在育性上表現為小孢子或花粉敗育而大孢子發育正常,但某些核基因能夠“校正”小孢子的敗育,因此CMS是核質互作的結果。在遺傳理論上,CMS是研究高等植物核基因調控胞質基因的理想體系;在生產上,CMS可被用于雜種生產而具有巨大的經濟價值。 長期的分子生物學研究已獲得許多有意義的結果,從不同植物的mtDNA、cpDNA中,已經分離到了大量的認為與CMS發生有關的DNA片段,基因或者ORF。在玉米等多種植物中,對CMS相關基因的轉錄、翻譯等也有詳細的研究,依據研究結果提出的假說甚至可以很好的解釋某些作物的CMS的發生。但這些結果在解釋不育機制時大多不具普適性,往往只能解釋某種特定作物、甚至特定類型CMS的發生,其部分原因可能是研究者所選實驗材料過于單一或材料間缺乏相關性。 在具不同的細胞核背景或細胞質類型的CMS植物中,尋找共同的、規律性出現的與CMS相關的基因或DNA片段,應更具有普適性的意義。因此我們選用了10個高粱CMS材料,函蓋了目前在高粱中發現的主要的A_1、A_2、A_3、A_4、A_5、A_6、9E等7種不育胞質類型,以及4種細胞核保持系、3個恢復系和2個雜種。這19個材料中,不同的CMS系之間,CMS系與相應的保持系之間,為同質異核、同核異質或異質異核關系。從不同的角度分析,可獲取關于不同類型的胞質或核基因組的結構信息。而且,這些材料中的A_1、A_2、A_3胞質系統的CMS材料間具有復雜的恢保關系。 為了獲得穩定的具代表性的與CMS相關的DNA片段,基于上述較系統而全面的材料,首先采用RAPD技術,選用了近200個10 mer的隨機引物擴增A_1Tx623A/B(196個引物),A_2V_4A/B的總DNA(184個引物),經多次重復,獲得5個總能在兩對材料中擴增出共同的與可育或不育胞質連鎖的DNA片段的引物。為檢驗這5個與兩種可育或不育胞質連鎖的DNA片段是否在更多種可育或不育胞質連鎖,將5個篩選出的引物擴增15個相關的CMS材料,發現有3 個 DNA片段很有規律:片段 SAP06950出現在所有的不育系和雜種 FI中,即與 不育胞質連鎖;與之相反,片段 SAAU刀27()0和 SAY*。出現在所有的保持系 和恢復系中,即與可育胞質連鎖。 鑒廠3個片段與*Ms的相關性,采用木實驗總結出的方法回收后,并進行 .州斑測序羽*予列分析;同卜卜 采用隊卜擴增、加吐憂rn雜交等方法,對這些片 段究竟是位r細胞核還是細胞質作了分析,結果如下: 1.片段SA刀6”,為不育胞質mtDNA特有的一新的不完整基因,與核DNA 存在同源性,并可能反映了A/B核DNA上存在差異。 序列分析表明,該片段全長967hp;在GenBank中無同源序列,是一個新的 *NAX段;經**Ns**N預測發現,該片段含有起始、中間兩個外顯子,編碼 223個氨基酸,含有一不完整的開放讀碼框(ORF)。blastx搜索亦未發現同源的 氨基酸序列,表明該片段編碼一個新的氨基酸。以總DNA,mtDNA及cPDNA 為模板的**R擴增,以及 h;;山ern雜交結果均表明該片段來自不育胞質的 mtDNA。比較分析總 DNA和 mtDNA的雜交圖譜后認為,該片段也存在于核DNA l-k。該片段與總DNA的雜交結果表明不育系與保持系核DNA上可能存在差異。 這些特性與CMS發生的關系是值得關注的。 2,片段SAAUo2m。CMS系葉綠體NAD(n脫氫酶第4亞基的基因存在 序列變異。 該片段實際測得28比p,為高粱叩ONA的n燦和呷C基因的部分序列, 也是首次測得的高粱 cpDNA的 dhj和 psaC基因的部分序列。PCR檢測和 Southern雜交也證實片段 SAAU刀2扣。為 cpDNA起源。該片段與 EcoR+Hnd Ill 雙酶切的總 DNA、CpDNA雜交,以及 IlaC Ill酶切的 AITX623/TX623的總 DNA 雜交結果,結合構建的對應于n dhdhD和尸一C基因區的酶切圖譜分析,發現*M S 系nD基因內的一個月bIHI位點發生了結構變異。 3.片段 SAYJ 9u。發現 CM S系與保持系的光系統 lpsaAI;尸。IA 2基因區 存在結構變異n 該片段實際全長為2447…為高粱【1-IW綠體尸s1AI,尸s1AZ基因的部分序列。 我們測得的pndl基因在 581位缺失一堿基 A,缺失產生的原因和對脫輔基蛋白 功能是否有影響待進一步研究I*R檢測和s加山ern雜交也表明該片段為叩**A 起源,Southern雜交顯示不育系和可育系[II綠體基因組存在差異。 片段 SAAU刀2700和 SAY刁 川0同源的基因均與光合作用密切相關,我們認 為可能從兩個方面對高粱CMS的發生產生影響:一是損害線粒體的能量代謝, -二是阻礙非儲存性淀粉粒在小泡子母細胞內的積累,使之缺乏用于構建必需新物 質的炭架等原料。 發現CMS系與保持系在核DNA上可能存在差異 以AITx623、hV4及T-c623 Vll 和 V4的總 DNA為模板,從近 200個 10 iner隨機引物中分別篩選到 15和 6個引 物,其*AP D擴增產物在Aj B間存在穩定差異。用它們分別擴增A/ B的總**A、 XtDNA及CpDNA。以AITX623/TX623總DNA為模板時得到的23個差異片段 中,有 17個在以胞質
      【學位授予單位】:西北大學
      【學位級別】:博士
      【學位授予年份】:2001
      【分類號】:Q943

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      9 倪斌;雞傳染性支氣管炎病毒陜西地方株的分離鑒定及S1基因的克隆和序列分析[D];西北農林科技大學;2005年
      10 王春芳;牛分枝桿菌MPB64基因的克隆與原核表達[D];吉林農業大學;2005年
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